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癌癥研究中方興未艾的免疫治療的思路主要包括免疫檢查點治療和細胞治療。這兩種思路是從提高免疫細胞功能的角度出發(fā)，為患者輸注藥物去增加免疫力。能不能從相反的角度出發(fā)，對于一些影響免疫力的蛋白做一些“減法”治療，即去除這些蛋白。這種藥物研發(fā)在之前是難以實現(xiàn)的，或者說是“難以成藥” 。但隨著一些新的藥物研發(fā)策略的興起，使這些蛋白有望成為新的靶點。
南京醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科殷詠梅副院長團隊成員與西北大學芬伯格醫(yī)學院羅伯特·盧里綜合癌癥中心的研究者剛剛在《Science Advances》雜志（影響因子：14.957）上發(fā)表了一篇題為“Proteolytic Regulation of CD73 Orchestrates Tumor Immunogenicity”（調(diào)控CD73的蛋白水解可調(diào)節(jié)腫瘤免疫原性）的論文給出了新的腫瘤治療思路。文章提到，乳腺癌是導致婦女癌癥死亡的第二大原因，對于女性的健康造成很大的威脅。其中三陰性乳腺癌（TNBC）被認為是一種“冷腫瘤”，對其治療選擇較少，也是侵襲性的乳腺癌形式，導致患者預后不良。在乳腺癌治療靶點的選擇上，除了免疫檢查點外，還存在CD73這類與腫瘤微環(huán)境免疫功能相關的蛋白。高水平的CD73與較差的預后相對應。與此同時，三結(jié)構域（TRIM）蛋白也與免疫調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生有關。TRIM蛋白本質(zhì)上是蛋白質(zhì)降解途徑的一部分，在其中它們發(fā)出某些蛋白質(zhì)的降解信號。先前的研究表明，TRIM21水平與疾病進展相對應，但迄今為止，它與癌癥免疫原性的關聯(lián)仍不清楚。
圖1：TRIM21low/CD73high的特征與不利的免疫反應相關
IsoPlexis（NASDAQ: ISO）公司總部位于美國的康涅狄格州，是一家專注于單細胞功能蛋白質(zhì)組分析解決方案的供應商。作為單細胞多組學的重要組成部分，IsoPlexis單細胞技術已被國內(nèi)外用戶廣泛認可，包括高?？蒲袡C構、全球Top 20的制藥企業(yè)、70%美國綜合性癌癥中心等，在臨床科研領域，針對評估和檢測人體單細胞免疫能力、篩選癌癥治療方案、預測評估臨床療效及安全性等方面有著豐富的成功經(jīng)驗，為預測病人長期生存、早期篩選治療獲益患者提供了詳實的參考數(shù)據(jù)，加速藥物研發(fā)上市及聯(lián)合療法開發(fā)應用。
通過使用IsoPlexis的檢測技術，各地的研究人員在Cell、Nature Medicine、Immunity、Journal of Clinical Oncology、Cancer Cell等高影響力期刊上發(fā)表多篇高分文章，并在腫瘤免疫、細胞治療、腫瘤學、抗感染免疫研究及疫苗開發(fā)、自身免疫病、移植免疫等方向取得了眾多突破性成果，應用于疾病發(fā)病和耐藥性機制研究、生物工藝優(yōu)化、預測及評估免疫相關不良反應的新型生物標志物，助力加速醫(yī)學和生命科學行業(yè)發(fā)展。
研究思路
研究者證實了CD73的高表達與所有乳腺癌分類中較低的生存率相關。然后，他們通過一些分子生物學技術揭示了CD73水平經(jīng)歷了一種被稱為泛素化的翻譯后修飾。泛素化本質(zhì)上是蛋白質(zhì)的一種降解信號。通過分子生物學技術和質(zhì)譜技術的結(jié)合發(fā)現(xiàn)這種蛋白水解信號的驅(qū)動因素是TRIM21。接下來，鑒定TRIM21作為控制CD73蛋白降解以調(diào)節(jié)T細胞功能的潛在泛素E3連接酶。
泛素化的關鍵是泛素肽附著（或連接）到賴氨酸殘基上。該小組試圖找出哪些賴氨酸殘基可能是CD73蛋白被泛素化的賴氨酸。他們鑒定了以下賴氨酸作為泛素化位點：K133、K208、K262和K321。為了確定這些賴氨酸對TRIM21介導的CD73降解的重要性，作者將這些特定殘基突變?yōu)榫彼?，理論上會阻斷泛素化，得到多個突變TNBC細胞系：MDA-MB468-CD734KR（這4個賴氨酸殘基均突變?yōu)榫彼幔?，MDA-MB468-CD73K133R/K208R（K133和K208的賴氨酸突變?yōu)榫彼幔?，MDA-MB468-CD73K262R/K321R（賴氨酸K262和K321突變?yōu)榫彼幔?/p>
IsoPlexis檢測方法
將MDA-MB468-CD73WT或MDA-MB468-CD734KR分別用APCP（CD73抑制劑）或不加APCP處理24小時，使用腫瘤條件培養(yǎng)基培養(yǎng)。收集突變TNBC細胞培養(yǎng)上清液。供體PBMCs加入收集的上清液，使用anti-CD3刺激，培養(yǎng)WT/No APCP、4KR/No APCP、WT/APCP或4KR/APCP四組細胞。在孵育72小時后，作者評估了供體PBMC分選的CD8+T細胞的多功能性和細胞多功能指數(shù)PSI。
研究者發(fā)現(xiàn)，與WT細胞的T細胞相比，加入突變細胞系培養(yǎng)上清的T細胞多功能和多功能指數(shù)總體耗盡。并且有趣的是，與未經(jīng)APCP處理的T細胞相比，經(jīng)APCP處理的T細胞的多功能性和PSI似乎略有增加（圖2）。
圖2：IsoPlexis檢測CD73及其泛素化位點突變
對于免疫細胞功能的影響
這意味著靶向CD73，通過增強其降解或簡單抑制其功能可能是增強免疫功能的可行選擇。他們也進行了進一步檢測以明確起關鍵作用的泛素化位點，培養(yǎng)MDA-MB468-CD73K133R/K208R和MDA-MB468-CD73K262R/K321R（圖3），評估其培養(yǎng)上清對于CD8+T細胞多功能和PSI的影響，結(jié)果顯示，K262和K321突變組的細胞多功能性和PSI均顯著降低，表明K262和K321是TRIM21介導CD73泛素化降解的關鍵賴氨酸位點。
圖3：IsoPlexis檢測確定起關鍵作用的泛素化位點
此外，研究發(fā)現(xiàn)，當用IFN?處理MDA-MB468細胞時，TRIM21水平顯著升高，CD73水平顯著降低。這表明，像CD8+T細胞這樣的IFN?分泌細胞的存在創(chuàng)造了一個反饋回路，從而提高腫瘤細胞中的TRIM21水平，進而耗盡CD73水平。最后，本文總結(jié)了小鼠和患者的體內(nèi)數(shù)據(jù)，探討了TRIM21水平如何與小鼠模型腫瘤負荷和患者更有利的免疫信號相關。總之，作者闡明了CD73如何促進TNBC的免疫逃避的機制，同時也揭示了CD73可以通過TRIM21進行調(diào)控的機制。最終，這些數(shù)據(jù)為靶向CD73以提高免疫療法和其他類型的治療方法的有效性提供了一個案例。
文章點評
文章點評
#1
在免疫檢查點治療策略之外，對付癌癥的“wuqi庫”永遠需要新的選項，評估這些選項的標準是什么？是用了很多年的檢測方式，還是研究人員比較“熟悉”的一些諸如濃度、成像、亞群等指標，抑或是“其他人”也在做的實驗方法。我們認為答案是否定的，需要用事實說話，臨床轉(zhuǎn)化研究中的事實就是能否與臨床結(jié)果建立相關性，這也是單細胞蛋白組技術對于臨床轉(zhuǎn)化及前期基礎研究的意義。
IsoPlexis平臺提供了評估免疫功能的標準，從而更好地確定治療策略是否有效，如為CD73等新靶點評估提供決定性的根據(jù)。
#2
#3
與免疫檢查點和細胞治療不同，新的泛素依賴的藥物研發(fā)路徑使之前“難以成藥”的蛋白成為新的靶點。要評估蛋白對于免疫微環(huán)境的影響，需要去檢測免疫細胞的免疫功能的變化，需要對于活的免疫細胞進行刺激，并且避免由于免疫細胞的功能異質(zhì)性而隱藏的重要信息，所以需要使用單細胞層面的功能蛋白組檢測，這使得單細胞功能蛋白組技術成為這類研究的不二zhixuan！
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